فصلنامه افق طلائی سلامت

معاونت بهداشتی دانشگاه علوم پزشکی زابل

تشخیص آزمایشگاهی دیفتری

تشخیص آزمایشگاهی دیفتری

( ویژه کارشناسان و کاردانهای بیماریها و علوم آزمایشگاهی )

تشخیص دیفتری با نمونه برداری توسط سواب از حلق؛ لوزه ها ؛بینی ویا پوست بیمار و بررسی آزمایشگاهی انجام می شود.

مراحل تشخیص آزمایشگاهی عبارت است از :

1- نمونه گیری

الف-  آماده سازی بیمار و تهیه وسایل لازم:


- جلب همکاری بیمار جهت نمونه گیری

- تکمیل پرسشنامه مربوط به هر بیمار(فرم شماره 1)

- دستکش ؛ ماسک  ؛ و برچسب

- سواب استریل جهت نمونه گیری (استفاده از ابسلانگ چوبی استریل برای پایین نگه داشتن زبان در حین نمونه گیری الزامی است.)

- لام میکروسکوپی تمیز جهت تهیه گستره و جعبه کوچک مخصوص لام جهت ارسال آن

- ظروف مناسب حاوی محیط کشت نگهدارنده جهت انتقال نمونه ها

- استفاده از محیط های کشت ترانسپورت Amies یا Stuart جهت جمع آوری و انتقال نمونه ها توصیه می گردد و چنانچه این محیط ها قبل از استفاده کاملا" در بسته باشند به مدت دو ماه در یخچال قابل نگهداری می باشند.

  ب - روش نمونه گیری:

1- وسایل لازم :                         - سواب استریل  8عدد      

-  آبسلانگ استریل   2-1 عدد         - دستکش و ماسک          

- محیط بلاد آگار حاوی خون گوسفندی (%5  SBA) 1 عدد

- محیط ترانسپورت Amies 3 عدد       - لام شیشه ایی       6عدد

توجه:

 1- کلیه وسایل و محیط های کشت ترانسپورت جهت نمونه گیری و انتقال نمونه ها در داخل کیت مخصوص نمونه برداری ؛ توسط آزمایشگاه کشوری دیفتری و سیاه سرفه (انستیتو پاستور ایران ) تهیه و ارسال می گردد.

2-رعایت کلیه موارد ایمنی از جمله استفاده از ماسک و دستکش حین نمونه گیری و همچنین اطمینان از واکسینه بودن افرادی که در معرض تماس با بیماران یا عامل مولد بیماری هستند لازم و ضروری است.

2-  موضع نمونه گیری و برداشت نمونه:

- حلق و لوزه های حلقی و اطراف آن 

- انتهای بینی و نازوفارنکس

- پوست در صورت وجود زخم ویا ترشحات جلدی

نمونه برداری از حلق و لوزه ها :

1- از بیمار خواسته شود تا دهان خود را باز کرده و با ادای صدای (ah) جهت نمونه گیری همکاری نماید (زبان بیمار را به آرامی با آبسلانگ استریل به پایین فشار دهید). یک نمونه از اگزودای جراحات حلق و در صورت وجود غشاء کاذب خاکستری رنگ یک نمونه هم از آن ناحیه تهیه نمایید.

2- جهت تسهیل در نمونه گیری باید دو سواب به صورت چسبیده و در کنار هم را در دست گرفت ومحکم به سطح ضایعات کشید.برای هر موضع نمونه گیری لازم است نمونه توسط دو سواب تهیه شود. یعنی برای اگزودای جراحات 2 سواب ؛ در صورت وجود غشاء کاذب خاکستری یا کرم رنگ 2 سواب و 2 سواب نیز برای تهیه دو عدد گسترش مستقیم از ضایعات (مجموعا" 6 سواب لازم است.)

ابتدا باید از غشاء کاذب نمونه گیری به عمل آید بطوریکه مقداری از آن کنده شود و سپس با کنار زدن این غشاء از جراحات زیر آن با شدت به وسیله سواب نمونه گیری نمود. 

نمونه برداری از انتهای بینی و نازوفارنکس:

انتهای بینی از مناطقی است که احتمال جدا سازی باسیل دیفتری در آنجا بیشتر است. ابتدا یک سواب استریل را به هر دو سوراخ بینی وارد نموده و به اندازه 3-2 سانتی متر به آرامی به داخل فرو می بریم.سپس چند لحظه صبر کرده تا ترشحات به آن جذب شوند. یک سواب از هر دو سوراخ بینی جهت کشت ویک سواب نیز برای تهیه یک عدد گستره مستقیم از هر دو طرف بینی باید گرفته شود.

نکته :

 1- سواب های تهیه شده از حلق و لوزه ها؛ شامل غشاء کاذب و جراحات زیر آن را روی دو محیط کشت ترانسپورت Amies   بطور جداگانه منتقل نموده وسپس قسمت اضافی آنها را شکسته و درب لوله را محکم ببندید.

2- سواب بینی هر دو طرف را در یک لوله محیط کشت Amies  منتقل نمایید.

3- نمونه ها را می توان حداکثر 48-24 ساعت در دمای اتاق نگهداری و ارسال نمود؛ در غیر اینصورت نمونه ها را در یخچال قرار داده و در اسرع وقت به انستیتو پاستور ایران ارسال نمایید.

2- تهیه گسترش مستقیم و رنگ آمیزی جهت بررسی میکروسکوپی:        

- از لام های میکروسکوپی تمیز استفاده نمایید.

- سواب حاوی نمونه را به آرامی در وسط لام به شکل بیضی کوچک و با حرکت دورانی بکشید.(گسترش غلیظ باید تهیه شود.)

- با چسباندن بر چسب بر روی هر لام مشخصات بیمار و محل نمونه گیری را یادداشت کنید.

- پس از خشک شدن گسترش ها در محیط آزمایشگاه ؛ هر 6 لام تهیه شده را به وسیله حرارت ( از روی شعله چراغ آزمایشگاه سه بار بگذرانید.) فیکس نموده و سپس رنگ آمیزی نمایید.

روش های رنگ آمیزی :

الف)رنگ آمیزی گرم: کورینه باکتریوم دیفتریه باسیل گرم مثبت بدون حرکت و فاقد اسپور می باشد.این ارگانیسم دارای اشکال گوناگون بوده و در اغلب موارد به صورت حروف الفبای چینی یا لاتین V وL  مجاور یکدیگر و یا به صورت منفرد و گرز مانند قرار دارند. این رنگ آمیزی جهت افتراق میکروارگانیسم از استرپتوکوک گروه A و همچنین اسپیروکت ها و باسیل های فوزیفرم مولد آنژین ونسان دارای اهمیت است.

روش رنگ آمیزی گرم: پس از تهیه گسترش و فیکس نمودن آن توسط شعله ؛ آن را بایستی به روش زیر رنگ آمیزی نمود.

- کریستال ویوله 60 ثانیه (یک دقیقه)     - لوگل60ثانیه (یک دقیقه)

- الکل استن (در حد رنگبری)              - فوشین         30ثانیه

ب) رنگ آمیزی آلبرت: در این رنگ آمیزی گرانول های متاکروماتیک (از جنس پلی مرهای فسفات و محل ذخیره انرژی باکتری ) بطور پراکنده ویا در دو قطب باسیل دیده می شوند ؛ که برای تشخیص دیفتری قطعی نمی باشد.          

روش رنک آمیزی آلبرت : پس از تهیه گسترش و فیکس نمودن آن بر روی شعله ؛ آن را به روش زیر رنگ آمیزی نمایید.

1- رنگ آلبرت 15دقیقه   2- لوگل آلبرت7  دقیقه   3- شستشو با آب7  دقیقه

روش تهیه رنگ آلبرت :

- تولوئیدین بلو   0.015گرم            - مالاشیت گرین                   0.2گرم

- اسید استیک گلاسیل     1 میلی لیتر       - الکل 95 درجه   2 میلی لیتر

- آب مقطر                    100میلی لیتر

3- کشت:

کورینه باکتریوم دیفتریه باکتری هوازی و بی هوازی اختیاری می باشد.ولی در شرایط هوازی بهتر و سریع تر رشد می نماید.و دمای مناسب جهت رشد آن 37-35 درجه سانتی گراد می باشد. افزودن خون یا سرم باعث تسریع رشد باکتری می شود.

محیط های کشت اختصاصی:استفاده از محیط های اختصاصی به منظور کشت و بررسی نمونه ها تنها توسط آزمایشگاه کشوری دیفتری وسیاه سرفه (انستیتو پاستور ایران) صورت می گیرد.

توجه :کلیه محیط های کشت باید حداقل به مدت 24 ساعت در حرارت 37-35 درجه سانتی گراد انکوبه شوند.پس از مشاهده کلنی های تیپیک کورینه باکتریوم دیفتریه ، از کلنی های ایزوله گسترش مستقیم جهت رنگ آمیزی گرم و آلبرت تهیه شده وسپس بر روی محیط لوفلر به صورت ایزوله کشت داده می شوند تا جهت انجام آزمایش های بیو شیمیایی مورد استفاده قرار گیرد.

4- آزمایش های بیو شیمیایی:

این آزمایش ها اغلب شامل تخمیر قند ها می باشند. کورینه باکتریوم دیفتریه با تخمیر گلوکز و مالتوز تولید اسید می کند ولی قادر به تخمیر لاکتوز ، مانیتول ، و ترهالوز نمی باشد. محیط پایه قندی HISS  است و نتیجه واکنش باید پس از 24 ساعت انکوباسینون در 37 درجه سانتی گراد مورد بررسی قرار گیرد. سایر واکنش ها شامل اوره آز منفی ، احیاء نیترات مثبت و هیدرولیز اسکولین منفی می باشد.

5- تعیین توکسین زایی :

برای سنجش توکسین زایی سویه های کورینه باکتریوم دیفتریه دو روش وجود دارد :

الف- invivo از طریق تزریق به خوکچه هندی :

1-تزریق زیر جلدی کورینه باکتریوم دیفتریه باعث مرگ حیوان غیر ایمن در عرض 2-1 روز می شود.

2-تزریق داخل جلدی کورینه باکتریوم دیفتریه در حیوان غیر ایمن باعث واکنش اریتماتو در محل تزیق در مدت 48 ساعت می شود.

ب- invitro  و با استفاده از روش ژل دیفیوژن و تست Elek

در محیط های کشت Elek ، نواری از کاغذ صافی آغشته به آنتی توکسین قرار داده ونمونه مشکوک را به صورت عمود بر آن کشت    می دهند. پس از72-48 ساعت خطوط رسوبی حاصل از تداخل       آنتی توکسین با توکسین به صورت زاویه 45 درجه مشاهده می شود.

آزمایش تعیین حساسیت میکروبی :

روش استاندارد و مرجع جهت تعیین حساسیت یا مقاومت این باکتری نسبت به آنتی بیوتیک های رایج درمانی وجود ندارد هر چند در اکثر موارد این میکروارگانیسم نسبت به آنتی بیوتیک های پنی سیلین و اریترومایسین حساس می باشد.

 6-  آزمایش های مولکولی:

از روش های مولکولی مانند PCR نیز می توان جهت تعیین گونه باکتری و سم زایی سویه ها استفاده نمود.

توجه :کلیه اقدامات و بررسی های آزما یشگاهی بایستی با رعایت دستور العملهای ایمنی شامل اصول اولیه حفاظت های شخصی مانند استفاده از دستکش ؛ ماسک؛ روپوش و ..... و در زیر هود بیولوژیک  (BSC)  کلاس II  انجام گیرد.

دستورالعمل اجرایی برنامه مراقبت آزمایشگاهی بیماری دیفتری :

- آزمایشگاه مرکز بهداشت شهرستان موظف است بر اساس دستورالعمل نمونه گیری اقدام به تهیه‌، رنگ آمیزی وگزارش لام مشکوک به دیفتری نماید.

- همزمان سایر گسترش های مستقیم و هم چنین نمونه موجود در محیط ترانسپورت به آزمایشگاه مرکزی معاونت بهداشتی دانشگاه یا دانشکده حداکثر ظرف مدت 24 ساعت با حفظ شرایط ایمنی ارسال گردد.

- آزمایشگاه مرکزی معاونت بهداشتی در صورت توانایی های لازم؛اقدام به کشت نمونه ها و بررسی گسترش های مستقیم نماید.

- لازم است یکسری از نمونه ها به صورت همزمان توسط معاونت بهداشتی دانشگاه /دانشکده به انستیتو پاستور تهران حداکثر طی مدت 48 ساعت ارسال گردد.

- فرم ارسال نمونه در سه نسخه تهیه ، یک نسخه در آزمایشگاه مرکز بهداشت شهرستان ، یک نسخه در معاونت بهداشتی ونسخه دیگر به همراه نمونه به انستیتو پاستور ارسال شود. لازم است فرم شماره 1 با دقت و بطور کامل تکمیل گردد و بر روی برچسب نمونه ها « آزمایشگاه کشوری دیفتری و سیاه سرفه ؛ انستیتو پاستور ایران » قید گردد.

- چنانچه امکان بررسی نمونه ها در آزمایشگاه استان یا شهرستان وجود نداشته باشد بهتر است در اسرع وقت 3  عدد محیط ترانسپورت دیفتری و 6 عدد لام مستقیم به همراه فرم ارسال نمونه ظرف 48 ساعت به آزمایشگاه کشوری دیفتری و سیاه سرفه انستیتو پاستور ایران ارسال گردد و در صورت تأخیر ؛ نمونه ها در یخچال نگهداری شده و ارسال گردند.

[ ۱۳۸٩/۱۱/۱٩ ] [ ٧:٥٢ ‎ق.ظ ] [ حسینعلی ستوده ]

[ نظرات () ]